15 czerwca 2004

Chrząstka stawowa – perspektywy naprawy

Problem naprawy ubytków chrząstki stawowej przyciąga uwagę wielu ośrodków badawczych. Ten „gorący” temat dał podstawę zawiązania – w październiku 1997 roku – Międzynarodowego Towarzystwa Naprawy Chrząstki (ang. ICRS) we Fryburgu, w Szwajcarii (1). Spotkania ICRS odbywają się co 2 lata – przyciągają ortopedów z całego świata. Powstają specjalistyczne wydawnictwa naukowe poświęcone chrząstce stawowej (2). Interesuje się nią Amerykańska Agencja Kosmiczna NASA, która funduje granty badawcze (3).
W Polsce najważniejszym od 1965 roku ośrodkiem naukowym zajmującym się chrząstką szklistą jest Pracownia Biologii Molekularnej Komórki, prowadzona przez prof. Stanisława Moskalewskiego. Temat ten podejmują nowe ośrodki przy Akademiach Medycznych w Białymstoku, Lublinie, Łodzi i Poznaniu. Niejednokrotnie chrząstka była tematem konferencji poświęconych chirurgii kolana.

W Klinice Ortopedycznej warszawskiej Akademii Medycznej prowadzone są badania nad odtworzeniem funkcji uszkodzonych stawów maziówkowych. Prace oparte na grantach narodowego Komitetu Badań Naukowych dotyczą ubytków kostnych, urazów więzadłowych oraz uszkodzeń powierzchni stawowej. We współpracy z inżynierami z krakowskiej Akademii Górniczo-Hutniczej i Politechniki Warszawskiej zawiązano zespół roboczy ds. inżynierii tkankowej. Prof. Jan Chłopek z Wydziału Ceramiki Specjalnej AGH wraz z zespołem opracowuje nowe wszczepy.

Celem poszukiwań badawczych jest odtworzenie uszkodzonej tkanki o strukturze organizacyjnej w pełni przypominającej chrząstkę, z jej niezwykłymi właściwościami mechanicznymi. Inżynieria tkankowa wykorzystuje biologiczne i inżynieryjne podstawy w badaniach nad komórką i tkanką
– dla uzyskania funkcjonalnych substytutów uszkodzonych tkanek. Ta interdyscyplinarna nauka ma służyć naprawie i odbudowie całych części ciała. Pierwsze sukcesy osiągnięto ze skórą, tkanką kostną i chrząstką stawową.

Od 18 lat w Szwecji (L. Peterson, Goeteborg) i od 9 lat w USA (licząc od zgody FDA w 1995 roku) wykonywane są wszczepy autologicznych chondrocytów namnożonych w hodowli tkankowej (ACI autologous chondrocyte implantation). Dobre wyniki odległe (ponad 10-letnie) opisywane w pracach dają nadzieję i potwierdzają słuszność poszukiwań badawczych.

Omawiana szwedzka metoda (lub nowojorska – wg: www.genzyme.com) polega na pobraniu niewielkiego (200-300 mg) fragmentu zdrowej chrząstki, a następnie uwolnieniu komórek chrzęstnych z macierzy. Wszystkie czynności wykonuje się w laboratorium komórkowym; wymagają one warunków jałowości. Wysokie koszty założenia i utrzymania pracowni (200000 USD) ograniczają aktywność naukową. Klinika Ortopedyczna współpracuje z pracownią warszawskiego Instytutu Onkologii, kierowaną przez prof. Jana Steffena, z zespołem dr. Henryka Skurzaka. Uzyskane żywe chondrocyty hodowane są w warunkach jałowych w inkubatorze. Zmiana pożywki odbywa się co 2-3 dni – przypomina podlewanie kwiatów. W czasie hodowli rośnie liczba komórek. Po 4 tygodniach i uzyskaniu 10-15 mln komórek hodowla jest gotowa do wszczepienia. Materiał własny chorego, w postaci zawiesiny własnych chondrocytów, umieszczany jest w miejscu ubytku chrzęstnego, pod przyszyty i uszczelniony płat okostnej. Zabieg sprowadza się właściwie do podania 0,5 ml zawiesiny do komory o objętości 2 ml (przyjmując dla ubytku pełnej grubości o powierzchni 4 cm2 i wysokości 5 mm). Poszukiwane są matryce tkankowe (z ang. scaffolds), które zachęcałyby chondrocyty do proliferacji, bez poświęcenia ważnych funkcji życiowych. W klinice prowadzono badania in vitro hodowli ludzkich chondrocytów na włókninie węglowej i gąbkach z polilaktydu. We Włoszech przedstawiono wyniki nad nośnikami zbudowanymi z kwasu hialuronowego.

Ostatnie lata przynoszą gwałtowny rozwój technologii laboratoryjnych, przypominający postęp w naukach klinicznych. Odtworzenie powierzchni całego stawu będzie wymagało wszczepów o średnicy 5 cm i grubości 5 mm. Stan obecny pozwala na hodowlę kultur o wysokiej gęstości komórkowej, nieprzekraczającej średnicy 5 mm. Osiągnięto to dzięki nowej generacji inkubatorów, nazwanych bioreaktorami. Pozwalają one na kontrolę odżywiania, odczynu (pH), precyzyjne mieszanie i monitorowanie sił trących. Siły te mają znaczący wpływ na morfologię, a przez nią – na mechaniczne właściwości chrząstki. Przepływ pożywki może być modulowany dla osiągnięcia zamierzonych parametrów tworzącej się macierzy chrzęstnej i rosnącej liczby chondrocytów. Wysoka koncentracja komórek i ich wzajemny kontakt zabezpieczają przed odróżnicowaniem chondrocytów, często występującym w hodowli jednowarstwowej. Bioreaktor pozwala jednocześnie na przyspieszenie proliferacji komórek.

W bioreaktorach mogą być wykorzystywane mikronośniki, tj. drobiny kolagenu czy dextran. Zawiesina jest ciągle mieszana w reaktorze. Do niej wysiewane (szczepione) są chondrocyty. Pożywkę wymienia się co kilka dni. Stwierdzono skrócenie czasu podwojenia liczby komórek do 2-3 dni – w porównaniu z 5 dniami na tradycyjnych płytkach Petriego. Jednocześnie zawiesina mikronośników wzmacnia utrzymanie cech fenotypowych chondrocytów.

Mechaniczne mieszanie pożywki może doprowadzić do powstania szkodliwego gradientu sił tarcia i uszkodzenia komórek. Opracowano system perfuzyjny z pompą perystaltyczną, umożliwiającą stały przepływ pożywki. Komórki zostały zawieszone na umocowanej matrycy. Po 9 dniach liczba komórek była wyższa niż w statycznej kontroli, a po dwóch tygodniach obserwowano wytworzenie prawidłowej macierzy z dojrzałymi fenotypowo chondrocytami. Po 50 dniach ciągłej perfuzji utworzona tkanka przypominała histologicznie i mechanicznie prawidłową chrząstkę.
Bioreaktor z obracającą się ścianą został opracowany w NASA. Składa się z dwóch koncentrycznych cylindrów. Wewnętrzny, stacjonarny pozwala na wymianę gazową. Zewnętrzny, nieprzepuszczalny obraca się powoli. Przestrzeń między nimi jest miejscem stałej perfuzji pożywki. Względny ruch pożywki w stosunku do matrycy z komórkami wynika z ruchu obrotowego cylindra. Środowisko to zachęca chondrocyty do agregacji i tworzenia tkanki. W ciągu 5 tygodni obserwacji odnotowano większy przyrost proteoglikanów (GAG) niż w kolbach z mieszadełkami. Powstała tkanka miała moduł równowagowy, dynamiczną sztywność i potencjał strumieniowy sięgający 25% świeżej chrząstki. Wzrost ciśnienia parcialnego tlenu w bioreaktorze nasilił syntezę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).
Stwierdzono wpływ sił mechanicznych na rozwój chrząstki. Poszukuje się systemów zewnętrznej mechanicznej stymulacji dla polepszenia jakości otrzymywanej chrząstki. Opracowano system perfuzyjny z pobudzaniem chondrocytów na matrycach przez przerywany wzrost ciśnienia hydrostatycznego. Zaobserwowano wzrost zawartości GAG po 5 tygodniach w porównaniu z kontrolą.

Rozwój inżynierii tkankowej z wykorzystaniem nowych technik, w tym bioreaktorów, pozwala na poprawę warunków hodowli komórkowej i przynosi nowe rozwiązania problemów leczenia ubytków chrzęstnych. Przyszłe badania poświęcone będą nowym matrycom, wykorzystaniu komórek dojrzałych czy progenitorowych, wykorzystaniu czynników wzrostu i bodźców mechanicznych oraz terapii genowej. Natura wektorów stosowanych w ortopedii będzie zależała od rodzaju schorzenia, biologii leczonej tkanki i wymaganego czasu ekspresji przeniesionego genu. Wymagany czas ekspresji genu czynników wzrostowych w terapii uszkodzeń chrząstki czy tkanki kostnej będzie krótki. Wydłużona ekspresja stanie się konieczna w leczeniu chorób genetycznych, tj. wrodzona łamliwość kości (osteogenesis imperfekta).

Piotr STRZELCZYK
Adres do korespondencji:
piotr_strzelczyk@wp.pl

Piotr Srzelczyk od 11 lat pracuje w Klinice Ortopedii i Traumatologii Akademii Medycznej w Warszawie – jest starszym asystentem i specjalistą w zakresie ortopedii i traumatologii. Jako stypendysta Fundacji Kościuszkowskiej odbył półroczny staż w Insall Scott Kelly Institute (w Nowym Jorku), znanym ośrodku chirurgii kolana i medycyny sportowej. W pracy klinicznej zajmuje się chorymi na hemofilię po endoprotezoplastykach stawów biodrowych i kolanowych. Interesuje się leczeniem ubytków powierzchni stawowej o różnej etiologii

1. The International Cartilage Repair Society, adres: www.cartilage.org
2. Osteoarthritis and Cartilage, www.oarsi.org
3. Freed, L. E. i współp. „In vitro cultivation of tissue engineered cartilage”, NASA, grant NAG9-836

Archiwum

Okręgowa Izba Lekarska w Warszawie im. prof. Jana Nielubowicza